مقاله مقایسه بررسی میزان آدنوزین تری فسفات در اسپرم مولدین ماهی کفال در شرایط مختلف

چکیده:
کفال ماهیان دریای خزر یکی از مهمترین ماهیان شیلا تی این دریا می باشند که امروزه اکثریت صید ماهیان دریای مذکور به خود اختصاص داده اند.:  هدف از این تحقیق بررسی میزان ATP اسپرم ماهی کفال طلایی  در شرایط زمانی، دمایی و تداوم بخش های مختلف بوده است.:  بدین منظور میزان ATP اسپرم های:
۱) نمونه های تازه در دماهای مختلف ۱۰-۱۲ درجه و ۱۸-۲۰ درجه سانتی گراد،
۲) نمونه های نگهداری شده در دماهای مختلف۴ (درجه و دمای اتاق) به مدت شش ساعت،
۳) نمونه های نگهداری شده در ( تداوم بخش های مختلف ( گلیسرول، محلول نمک ۷/۰ %، محلول نمک  ۶۵/۰%)  به مدت ۵ و ۱۰ روز، به روش فوق حساس بیو- لومینوسانس اندازه گیری گردید.
بر اساس آزمایش های انجام شده در این تحقیق غلظت ATP اسپرم های تازه نمونه گیری شده در دمای ۱۰ تا ۱۲ درجه سانتیگراد ۲۲/۷ ±۰۴/۷۴%  غلظت ATP اسپرم های تازه نمونه گیری شده در دمای ۱۸ تا ۲۰ درجه بود. اسپرم های نگهداری شده در دمای ۴ درجه و دمای آزمایشگاه به مدت ۶ ساعت به ترتیب   ۹۱/۰ ±۲۶/۹۰%   و ۴۹/۱ ±۱۷/۱۷%  ATP  خود را حفظ کردند.
نگهداری اسپرم در تداوم بخش های مختلف( گلیسرول، محلول نمک ۷/۰ %، محلول نمک ۶۵/۰% ) به مدت  ۵ روز نشان داد که گلیسرول و محلول نمک ۶۵/۰% درصد بالاتری از ATP را نسبت به محلول نمک ۷/۰% حفظ کردند و نگهداری اسپرم در همان تداوم بخش ها به مدت ۱۰ روز نشان داد که گلیسرول درصد بالاتری از ATP را نسبت به محلول نمک ۷/۰% و ۶۵/۰% حفظ کرد.
براساس نتایج بدست آمده برای حفظ میزان ATP اسپرم ماهی کفال طلایی  نمونه گیری در دمای ۱۸-۲۰ درجه و نگهداری در گلیسرول توصیه می شود.

واژگان کلیدی: اسپرم، ماهی کفال طلایی، ATP،

مقدمه:

اسپرم به عنوان یک عامل مهم تولید مثل، بقاء و تداوم نسل است. بررسی اسپرم از نظر پارامترهایی چون توانایی تلقیح، تحرک، درصد اسپرم های متحرک، سرعت حرکت، فرکانس ضربه تاژکی، میزان  ATP و فاکتورهای شیمیایی و بیو شیمیایی، در تشخیص کیفیت اسپرم و کنترل روند تولید مثلی موجودات زنده از جمله آبزیان به ما کمک می کند. به همین علت تاکنون تحقیقات گسترده ایی توسط پژوهشگران مختلف روی این سلول صورت گرفته است. با این حال مطالعات انجام شده در ارتباط با میزان ATP  اسپرم ماهیان نسبتا کم است. این امر تفسیر علت ناموفق بودن مقاله های پرورشی کردن برخی ماهیان را دشوار می کند. در این رابطه باید مطالعات بیشتری در زمینه بررسی میزان           ATP اسپرم ماهیان صورت پذیرد. اسپرم به کمک حرکت ضربه ایی تاژک خود شنا می کند. انرژی مورد نیاز برای این حرکت از طریق هیدرولیزATP  فراهم می شود.(۱).تحرک اسپرم به میزان ATP ذخیره ایی اولیه(۲)  و میزان  ATP سنتز شده در طول فاز تحرک (۳) وابسته است. در اکثر ماهیانی که دارای لقاح خارجی هستند،ATP  سنتاز قادر به نگهداری نسبت های بالای ATP  هیدرولیز شده مورد نیاز در طول حرکت نیست لذا میزان  ATP به سرعت کاهش می یابد. این کاهش ATP  به موازات کاهش تعداد ضربات تاژکی و سرعت حرکت اسپرم است(۲).  یک رابطه خطی بین ظرفیت تلقیح اسپرم و پارامترهای اسپرمی از جمله میزان ATP  و سرعت حرکت اسپرم وجود دارد(۴) آنزیم اصلی تبدیل انرژی شیمیایی گرادیان پروتون در سیستم بیولوژیکی ، ATP سنتتاز است. این آنزیم برای سنتز ATP از ADP و فسفات غیرآلی استفاده می کند ساختمان و عملکرد این آنزیم در گونه های مختلف یکسان است (۵)  تفاوت قابل توجهی بین گونه ها در مقدار ATPمورد نیاز برای تامین حرکت اسپرم وجود دارد(۶). تحقیقی در رابطه با میزان ATP اسپرم ماهی کفال طلایی تاکنون صورت نگرفته است. در این مقاله سعی بر آن داشتیم که میزانATP  اسپرم ماهی کفال طلایی را در شرایط مختلف اندازه گیری نماییم.
مواد و روشها:

به منظور بیان میزان ATP برحسب تعداد سلول ، تعداد اسپرم های موجود در یک میلی لیتر از مایع اسپرم اخذ شده از ۱۰ ماهی نر کفال طلایی ، به کمک لام نئوبار و میکروسکوپ نوری (NIKON Y100) مورد شمارش قرار گرفت. در این تحقیق جهت بررسی تاثیر دمای نمونه گیری و میزان ATP اسپرم ماهی ، نمونه گیری در دو دمای  ◦C 10-12 و۱۸-۲۰ ◦C  انجام شد . ما در این تحقیق برای اندازه گیری میزان ATP از روش بیولومینوسانس استفاده کردیم بدین شکل که نمونه اسپرم را به نسبت ۱۰۰/۱ در محلول بافر HEPES جوشان مخلوط کرده  سپس  ۵۰ از آن را با   ۵۰ از محلول کیت حساس بیولومینو سانس (Biaffin) در پلیت مخصوص اندازه گیری لومینوسانس با هم مخلوط کرده و سینگالهای لومینوسانس را با استفاده از دستگاه لومینومتر

۱۰-۱۹ mol/well, Germany) × (Lumistar ,BMG labtech GmbH, 5اندازه گیری کرده و سپس میزان ATP هرنمونه را با استفاده از استانداردهای ATP محاسبه کرده  و بصورت nmol/108  اسپرم بیان کردیم.
درجه حرارت نگهداری اسپرم ها بر میزان ATP سلول های مذکور تاثیرگذار خواهد بود. لذا جهت بررسی دمای مناسب نگهداری ، اسپرم ها به مدت ۶ ساعت در دمای  ۴ درجه و دمای آزمایشگاه نگهداری و سپس میزان ATP آن ها مورد اندازه گیری قرار گرفت. معمولا برای نگهداری اسپرم از محلول های تداوم بخشExtenders )) استفاده می کنند این محلول ها سبب تداوم و حفظ فعالیت اسپرم ها در دوره نگهداری می شوند. به منظور بررسی بهترین محلول تداوم بخش ، محلول گلیسرول ۱۰ درصد و گلوکز ۰٫۳ مولار ، محلول نمک ۰٫۷ درصد و محلول نمک ۰٫۶۵ درصد مورد بررسی قرار گرفتند . میزان ATP اسپرم ها در محلول های مذکور پس از نگهداری اسپرم در دمای منفی ۱۵ درجه در زمان های ۵ و ۱۰ روز مورد سنجش قرار گرفت.
جهت انجام تحقیق در روز دهم آبان  ۱۳۸۴از دریاچه خزر که دمای آب آن  ۱۸ تا ۲۰◦C و شوری آن  ۱۲ تا  ۱۳ ppm بود و همچنین در روز  ۱۷ آبان  ۱۳۸۴ در پی کولاک و کاهش چشمگیردمای هوا از دریاچه خزرکه دمای آب آن ۱۰  تا ۱۲ ◦C و شوری آن  ۱۲ تا ppm 13
بود تعدادی ماهی کفال  طلایی صید کرده و پس از تعیین جنسیت، نمونه های نری را که هنوز اسپرم ریزی نکرده بودند انتخاب نموده و از بین آنها از ۱۰ ماهی نر با طول تقریبی۲۵  تا  ۳۰cm و وزن  ۹۰۰ تا  ۱۱۰۰g نمونه گیری شد. بعد از نمونه گیری ، بلافاصله درب لوله های آزمایش توسط نوار پارافیلم محکم بسته شده و در جعبه یخ  ۴ ◦C به آزمایشگاه منتقل شدند. در واقع اسمولالیته پائین ادرار با تحریک اولیه موجب کاهش اولیه ذخیره ATP سلولی و کاهش کیفیت اسپرم کپور می شود. لذا ما برای ممانعت از کاهش کیفیت اسپرم، در طول نمونه گیری از آلوده شدن اسپرم به ادرار و هر گونه ماده آلوده کننده ای جلوگیری کردیم.
به منظور بررسی میزان  ATP  نمونه اسپرم نگهداری شده در شرایط آزمایشگاه و دمای  ۴ ◦C  به مدت ۶  ساعت، مقداری از نمونه اسپرم هر ماهی که در دمای ۱۰  تا ◦C 12 نمونه گیری شده ، در شرایط آزمایشگاه  (۲۲ ◦C) و مقداری در دمای  ◦C 4  نگهداری شد. همچنین به منظور بررسی میزان ATP نمونه اسپرم نگهداری شده در سرما در تداوم بخش های مختلف (محلول گلیسرول ۱۰% و گلوکز ۳/۰ مولار، محلول نمک ۷/۰% ، محلول نمک ۶۵/۰% ) بعد از ۵ و ۱۰ روز ، یک حجم از اسپرم را با سه حجم از محلول تداوم بخش به آرامی مخلوط نموده و نمونه های اسپرم مخلوط شده با گلیسرول و محلول نمک ۶۵/۰%  در دمای  -۱۵ ◦C و نمونه های مخلوط شده با محلول نمک  ۷/۰% در دمای  ۱◦C بالای یخچال  نگهداری شد.
برای بررسی میزان  ATP نمونه اسپرم های تازه نمونه گیری شده (در دمای ۱۸  تا ◦C   ۲۰  و ۱۰  تا ◦C 12 آب دریا) و نگهداری شده (در دمای آزمایشگاه (۲۲◦C)  و◦C 4)، ابتدا باید نمونه اسپرم هرماهی را به نسبت  ۱:۱۰۰درمحلول بافر HEPES(pH=7.7, EDTA  ۲ mM ,  ( ۲۵ mM  HEPES , 10 mM Magnesium Chloride در میکرو ویال رقیق کرد. سپس میکرو ویال را در حمام آب جوش ◦C  ۱۰۰قرار داده تا در اثر حرارت، محتوی میکرو ویال شروع به جوشیدن کند.  پس از کمی جوشیدن محتوی میکرو ویال، آنرا خارج کرده ، که در حقیقت در اثر این حرارت غشاء سلول اسپرم تجزیه شده و  ATP سلول آزاد میشود(۸).  درمرحله بعد به   ۵۰ از محلول کیت حساس بیو لومینوسانس ( کیت شامل دو محلول و دو پودر جامد می باشد که محلول های آن شامل لوسیفراز وبافر است سپس پودرهای جامد که شامل دی تیوتریتیول (DTT)و لوسیفرین می باشد را طبق دستور بروشور کیت باهم مخلوط کرده و یک مخلوط  نهایی به دست می آید که برای انجام آزمایش می بایست ۵۰ میکرولیتر از این مخلوط نهایی با ۵۰ میکرو لیتر از محلول مورد اندازه گیری باهم در پلیت اندازه گیری لومینوسانس مخلوط کرد. کیت حساس بیولومینوسانس ساخت شرکت  Biaffin  آلمان می باشد).  سیگنالهای لومینوسانس در دمای اتاق به کمک دستگاه لومینومتر بعد از  ۱۰ دقیقه اندازه گیری شدند.و افزایش این زمان به بیش از ۳۰ دقیقه سبب کاهش سیگنال و عدم اعتبار منحنی استاندارد خواهد شد. سپس پلیت را وارد دستگاه لومینومتر کرده تا سیگنالهای لومینوسانس را اندازه گیری نماید. در مرحله بعد سیگنالهای لومینوسانس را بر اساس استانداردهای  ATP به صورت  nM  ATP درآورده و در نهایت غلظتATP   هر نمونه اسپرم ماهی را بصورت nM  ATP به ازای  ۱۰۸ اسپرم بیان کردیم.
به منظور بررسی میزانATP  نمونه اسپرم نگهداری شده در سرما و تداوم بخش های مختلف بعد از ۵ و۱۰  روز، ابتدا نمونه های منجمد شده در دمای ) -۱۵ ◦C (نمونه نگهداری شده در گلیسرول و محلول نمک ( ۶۵/۰%  از فریزر خارج کرده و به مدت ۳۰ ثانیه در دمای ۳۷  ◦C قرار داده تا ذوب شوند( ۹).  مراحل آزمایش برای نمونه های نگهداری شده در سرما و تداوم بخش های مختلف بعد از ۵ و ۱۰ روز مجددا تکرار شدند.

نتایج:

نتیجه میانگین شمارش تعداد اسپرم های مذکور برحسب ×۱۰۸ تعداد اسپرم  به صورت زیر بود: ماهی اول : ۲۲۰، دوم: ۲۵۸، سوم: ۲۴۵، چهارم:۲۰۰، پنجم:۲۹۰، ششم : ۲۷۵، هفتم : ۳۱۵، هشتم : ۲۳۵، نهم:۱۸۰، دهم:۱۷۰ بود. نتایج بررسی اثر دما بر غلظت ATP در اسپرم ماهی کفال طلایی در نمودار شماره یک ارائه شده است . نتیجه بررسی اثر دما بر نگهداری اسپرم ماهی کفال طلایی در نمودار شماره ۲ آورده شده است . نتیجه اندازه گیری تداوم فعالیت اسپرم ها در محلول های مختلف در نمودار شماره ۳ ارائه شده است . روند تغییرات میزان ATP در محلول های مختلف تداوم بخش طی زمان نگهداری ۱۰ روزه در نمودار شماره ۴ آورده شده است . بررسی نتایج کسب شده نشان داد:
۱-  بررسی غلظتATP اسپرمهای تازه نمونه گیری شده در دماهای مختلف.
غلظت ATP اسپرمهای تازه نمونه گیری شده در دمای ◦C  ۱۰-۱۲، ۲۲/۷ ۰۴/۷۴% غلظت ATP اسپرمهای تازه نمونه گیری شده در دمای  ◦C20-18 بود
(اسپرم نمونه گیری شده در دمای ◦C 20-18 ،sperm  nmol/108  ۰۹/۱ ۰۴/ ۱۷، N=10 ، اسپرم نمونه گیری شده در دمای ◦C 12-10، sperm nmol/108
۹/۰  ۲۱/۱۲ ، N=10 ، ۰۵/۰P>  ).

فهرست مطالب

چکیده:    ۲

مقدمه:    ۴

مواد و روشها:    ۵

نتایج:      ۹

بحث و نتیجه گیری    ۱۳

نتیجه گیری و پیشنهادات:    ۱۶