دانلود تحقیق و مقاله رایگان با عنوان نقشه برداری فیزیکی ژنهای انسان
نقشه برداری فیزیکی ژنهای انسان
نقشه برداری فیزیکی ، با استفاده از سنجشهایی که نمایانگر فاصله فیزیکی بین ژنها می‌باشند محل ژنها را روی جایگاههای خاصی در طول کروموزوم تعیین می‌کند. نقشه برداری فیزیکی ژنها ، شامل انواعی از روشهای متفاوت است که هر یک از آنها از واحدهای اندازه گیری مختلفی استفاده می‌کند و سطوح مختلفی از قدرت تکنیکی ، از کروموزوم کامل تا یک جفت باز منفرد فراهم می‌سازد.
دید کلی
در ابتدا تعیین کروموزومها منحصرا با مطالعات روی خانواده‌ها در شجره‌های بزرگ جمعیت و مشخص کردن شیوه توارث صورت می‌گرفت. به این طریق ژنهای مربوط به صفات وابسته به جنس را می‌توانستیم به محلی در کروموزوم جنسی نسبت دهیم. زیرا این صفات طرح انتقال منحصر به فردی نشان می‌دادند. به علاوه تعداد کمی از صفات اتوزومی غالب یا هم تراز را به هر یک از اتوزومها نسبت می‌دادند، زیرا خوشبختانه کشف شده بود که فنوتیپ صفات ، از طریق نسلهای متمادی همراه با یک گروه خونی خاص یا یک کروموزوم ، به ارث می‌رسد.
به هر حال نمی‌توانستیم اکثریت ژنهای انسانی را به این روش یا روشهای دیگر نقشه برداری کنیم تا اینکه شیوه نقشه برداری فیزیکی و نقشه برداری ژنتیکی ، ابداع شد. دو روش اساسا متفاوت برای جمع بندی نقشه‌های ژنی کروموزومهای انسان وجود دارد. نقشه برداری فیزیکی و نقشه برداری ژنتیکی. در نقشه برداری فیزیکی ، با استفاده از سنجشهایی که نمایانگر فاصله فیزیکی بین ژنهاست، محل ژنها را در جایگاههای خاص در کروموزوم تعیین می‌کنند. در قدرت تفکیک کم ، نقشه‌های فیزیکی بر حسب نوارهای ژنتیک سلولی در کروموزومهای متافازی ، محل ژن را مشخص می‌کنند و در قدرت تفکیک حداکثر ، نقشه برداری فیزیکی ، جایگاهها و فواصل بین ژنها را در سنجشهای فیزیکی واقعی مانند طول DNA (در واحد جفت باز) تعیین می‌کنند.
ژنتیک سلولهای پیکری
ژنتیک سلولهای پیکری ، مطالعه سازمان یابی ، بروز و تنظیم بیان ژن در سلولهای کشت داده شده بدست آمده از بافتهای پیکری (در مقابل رده زاینده) است. ژنتیک سلولهای پیکری از توانایی رشدی تعدادی از انواع مختلف سلولها در کشت سلولی بهره می‌برد. حفظ موفقیت آمیز کشتها برای زمانی طولانی مستلزم ایجاد محیطهایی است که نیازهای تغذیه‌ای سلولها را برآورده کنند.
کشت سلولی در بسیاری از شرایط مفید بوده است. این روش ، تزاید یک سلول منفرد با ساختار ژنتیکی معین را جهت ایجاد تعداد زیادی سلول که از نظر ژنتیکی با سلول اولیه یکسان باشند، مقدور می‌سازد. فیبروبلاستها که معمولا از نمونه‌های پوستی کوچک تکثیر داده می‌شوند از مفیدترین انواع سلول برای مطالعات ژنتیک سلولهای پیکری می‌باشند.
نقشه برداری از طریق انتقال کروموزوم
انتقال کروموزوم ، شیوه آزمایشگاهی پرقدرتی است که انتقال کروموزومهای کامل یا قطعاتی از کروموزومها را از یک سلول دهنده به یک سلول پذیرنده در کشت مقدور می‌سازد. به محض آنکه مشخص شد انسان و سلولهای سایر پستانداران را میتوان در محیط کشت حفظ کرد متخصصان ژنتیک شروع به انتقال کروموزومها از سلولهای یک گونه به سلولهای گونه دیگر کردند تا ژنهای مختلف و اللهای آنها را به صورت دودمانهای مجزای سلولی جدا کنند. با تعیین اینکه پس از انتقال کروموزومها یا قطعات کروموزومی خاص ، کدام ژنها در یک سلول گیرنده وجود دارند، میتوان جایگاه کروموزومی ژنهای انتقال یافته را تعیین کرد.
هیبرید سازی سلول پیکری
رایج‌ترین روش انتقال کروموزم ، ادغام کردن سلولهای پیکری از گونه‌های مختلف جهت ایجاد هیبریدهای سلولی پیکری است. وقتی آمیخته‌ای از سلولهای پیکری انسان و جوندگان را که به صورت تک لایه یا در سوسپانسیون رشد می‌کند، در معرض ترکیباتی قرار دهیم که ادغام غشای پلاسمایی سلولها را پیش می‌برند، ممکن است دو سلول در هم ادغام شوند و یک سلول هیبرید منفرد ایجاد کنند. بلافاصله پس از ادغام ، دو هسته در داخل سیتوپلاسم یکسانی مجزا نگه داشته می‌شوند. اگر هیبرید تازه تشکیل شده حاوی هسته‌هایی از دو گونه متفاوت مانند انسان و جونده باشد، به آن هسته هتروکاریون گفته می‌شود.
پس از آنکه یک هتروکاریون ، تحت میتوز قرار گرفت، محتوای دو هسته به صورت یک هسته هیبرید منفرد ، در هم ادغام می‌شوند و با تقسیم سلولی بیشتر ، تعداد متغیری از کروموزومهای انسانی را بطور تصادفی از هیبریدهای انسان- جونده از دست می‌دهند که علل آن ناشناخته است. در نتیجه از دست رفتن تصادفی کروموزومهای انسانی ، سلولهای هیبریدی دختر مختلف حاوی تعداد و ترکیبات متفاوتی از کروموزومهای انسانی می‌باشند. با استفاده از تعدادی روش تعیین کاریوتیپ که کروموزومهای جوندگان و انسان را از هم افتراق می‌دهند، میتوان هر دودمان مستقل از سلولهای هیبریدی را مجزا کرد و از نظر محتوای کروموزوم انسانی تجزیه و تحلیل نمود.
پانلهای نقشه برداری هیبرید سلولهای پیکری
از دست دادن یا حفظ تصادفی کروموزومها در هیبریدهای هتروکاریون ، دودمانهایی حاوی زیر گروههای مختلفی از کروموزومهای انسانی را ایجاد می‌کند. میتوان گروهی از دودمانهای هیبرید سلولهای پیکری مستقل را که پانل (Panel) نامیده می‌شود، برای نقشه برداری یک ژن یا قطعه DNA انسانی روی کروموزوم انسانی خاص استفاده کرد که این کار با آزمایش ساده هیبریدها در پانل صورت می‌گیرد و هر یک از آنها حامل کروموزومهای انسانی متفاوتی از نظر وجود یا فقدان یک ژن خاص است. نتایج را با کروموزومهای انسانی باقیمانده در هر هیبرید تطبیق می‌دهند تا میزان همبستگی بین وجود یک کروموزم خاص و وجود ژن را تعیین کنند.
به این طریق ، مثلا وجود یا فقدان ژن آنزیم هگزوز آمینیداز A که جهشهای آن موجب بیماری تی‌ساکس می‌شوند، مرتبط با وجود کروموزم انسانی 15 در پانلی از هیبریدهای سلول پیکری نشان داده شده است. تمام هیبریدهایی که کروموزوم انسانی 15 را حفظ کرده‌اند، حاوی ژن این آنزیم بودند. هیچ یک از هیبریدهای فاقد کروموزوم 15 واجد ژن این آنزیم نبودند. این همبستگی کامل ، صرفا برای کروموزوم 15 و نه برای کروموزوم دیگری از انسان مشاهده شده، لذا میتوان ژن آنزیم هگزوز آمینیداز A را به کروموزوم 15 نسبت داد. این نوع تجزیه تحلیل همبستگی در پانلی از هیبریدهای هتروکاریون ، ما را قادر به انتساب هزاران ژن به هر یک از کروموزومهای انسانی کرده است.
تعیین محل ژن روی ناحیه خاصی از یک کروموزوم
مطالعات با استفاده از هیبریدهای انسان – جونده ، انتساب یک ژن به کروموزوم خاصی را مقدور می‌سازند. با جداسازی کروموزومهای انسانی دارای ساختمان غیر طبیعی ، در هیبریدهای سلولهای پیکری میتوان قدرت تفکیک را بالا برد. اگر ژن خاصی فقط در آن دسته از هیبریدهایی که کروموزوم حذف شده یا جابجا شده دارند موجود باشد، میتوان محل ژن را در بخش از کروموزوم حفظ شده در هیبریدها تعیین کرد. از طرف دیگر ، اگر محل ژنی روی یک کروموزوم خاص معلوم باشد، اما این ژن در هیبریدی حاوی یک نسخه حذف شده یا جابجا شده از آن کروموزوم وجود نداشته باشد، محل ژن را میتوان به بخش کروموزوم غایب منتسب کرد.
نقشه برداری هیبرید پرتویی
اگر چه هیبریدسازی سلولهای پیکری با کروموزومهای واجد ساختمان غیر طبیعی می‌تواند محل یک ژن را روی بخش خاصی از یک کروموزوم تعیین کند، نواحی کروموزومی مشخص شده هنوز در مقایسه با اندازه یک ژن متوسط ، کاملا بزرگ محسوب می‌شوند. با نقشه برداری هیبرید پرتویی ، میتوان نقشه برداری ژنی را با قدرت تفکیک به مراتب بالاتر انجام داد. در این روش ، سلولهای انسانی را تا حد کشنده‌ای تحت اشعه ایکس قرار می‌دهند تا کروموزومها قطعه قطعه شوند وسپس آنها را با سلولهای پیکری یک جونده که فاقد آنزیم هیپوگزانتین گوانین فسفوریبوزیل ترانسفراز است، هیبرید می‌کنند.
هیبریدهای حاوی قطعات کروموزومی انسانی را میتوان به کمک انتخاب در محیط کشت HAT از هم جدا کرد، زیرا هیبریدهای حاوی قطعه کروموزوم حامل هیپوگزانتین گوانین فسفوریبوزیل ترانسفراز (HPRT) ، همیشه واجد نوعی آرایش تصادفی قطعات کروموزومی انسانی دیگر نیز می‌باشند. سلولهای انسانی ادغام نشده ، بر اثر صدمه کروموزومی شدید می‌میرند. در حالی که سلول های ادغام نشده سلول جونده فاقد (HPRT) در محیط کشت HAT می‌میرند.
هر چه دو ژن انسانی روی کروموزوم به هم نزدیکتر باشند، احتمال بروز شکستگی ناشی از پرتو ایکس بین آنها کمتر است. در نتیجه دو ژن مجاور هم از نظر فیزیکی ، در بسیاری از هیبریدهای یکسان حفظ می‌شوند. اما ژنهایی که نزدیک یکدیگر نیستند، معمولا روی قطعات کروموزومی مختلف قرار دارند و در هیبریدهای یکسان موجود نیستند. نوعی تجزیه و تحلیل آماری در مورد اینکه میزان همبستگی دو ژن در دودمانهای هیبرید پرتویی چقدر است، سنجشی از فاصله بین دو ژن فراهم می‌کند. با استفاده از مقادیر کمتر یا بیشتر پرتوهای ایکس جهت ایجاد فراوانیهای مختلف شکست و در نتیجه قطعات با اندازه‌های متغیر میتوان قدرت تفکیک نقشه برداری هیبرید پرتویی را تنظیم کرد.
تکنیک FISH
نقشه برداری ژنی با استفاده از هیبریدسازی فلورسانس درجا
با استفاده از شیوه هیبریدسازی درجا که شامل هیبرید کردن مستقیم کاوشگرهای DNA یا RNA نشاندار با کروموزومهای متافازی است، میتوان محل ژن را مستقیما مشاهده کرد. دو رشته DNA کروموزوم متافازی را در روی لام از هم جدا می‌کنند تا هیبرید کردن با یک کاوشگر نشاندار مقدور شود. سپس محل علامت هیبرید سازی و در نتیجه جایگاه ژنی که کاوشگر با آن هیبرید می‌شود، در زیر میکروسکوپ تعیین می‌گردد. شیوه‌هایی برای نقشه برداری توالیهای ژنی تک نسخه‌ای به روش هیبریدسازی درجا ایجاد شده‌اند که شناسایی سریع کاوشگرهای هیبرید شده نشاندار غیر رادیواکتیو با ترکیبات قابل مشاهده در زیر میکروسکوپ فلوروسانس را امکان پذیر می‌سازند. حتی در یک گسترش متافازی منفرد میتوان محل ژن مورد نقشه برداری را به راحتی دید.
هیبریدسازی فلوروسانس درجا (FISH) ، همراه با شیوه‌های نوار بندی برای شناسایی کروموزومها ، برای تعیین محل ژنها در ناحیه‌ای به اندازه 2 – 1 میلیون جفت باز در طول کروماتین بسیار متراکم شده یک کروموزوم متافازی یا پرومتافازی ، بکار می‌رود.نقشه برداری با قدرت تفکیک تا حدی بیشتر ، از طریق نقشه برداری FISH ، قطعات DNA با استفاده از رشته‌های کروماتینی اینترفازی (FISH رشته‌ای) که تراکم به مراتب کمتری نسبت به کروموزومهای متافازی دارند، قابل انجام است. از طریق نشاندار کردن با رنگهای مختلف ، نشانگرهایی به نزدیکی چند صد کیلو باز از هم ، جداسازی شده‌اند و ترتیب آنها در رابطه با یکدیگر تعیین شده است. FISH رشته‌ای در تحقیقات پیرامون شناسایی ژنهای بیماریهای انسانی بسیار کمک کننده بوده است. زیرا این روش اطلاعات جزء به جزء در مورد ترتیب و فاصله بین هر یک از ژنها در مجاورت یک ژن بیماری فراهم می‌سازد.
چشم انداز بحث
نقشه برداری از ژنهای انسان یکی از سریع‌الرشد ترین حوزه‌های مطالعه در ژنتیک پزشکی امروزی است. داشتن نقشه ژنی کامل انسان ، به معنای دانستن جایگاه تقریبا 5 هزار ژن روی 24 کروموزوم ، محلهای آنها در ارتباط با یکدیگر و فواصل بین آنهاست. این اطلاعات نقشه‌ای بسیار با ارزش است. نه تنها از این جهت که میتوان از آن برای تشخیص بیماریها و مشاوره ژنتیکی استفاده کرد بلکه به این علت که روش مستقیمی برای شناسایی ژنهای مسئول بیماریهای ژنتیکی فراهم می‌کند.
مطالب مرتبط