دانلود تحقیق و مقاله رایگان با عنوان مقایسه روشهای مختلف استخراج DNA برای ژنوتایپینگ
مقایسه روشهای مختلف استخراج DNA برای ژنوتایپینگ دامها با نشانگرهای PCR-RAPD و PCR-RFLP
چکیده:
امروزه برای شناسائی جهشهای موجود در سطح ژنوم پستانداران می توان از تکنیکهای مختلفی همچون روشهای مبتی بر PCR از جمله Microsatellite، SSCP، AFLP، RFLP، DGGE و ARMS استفاده نمود. این تکنیکها عمدتا برای نقشه یابی ژنها، تشخیص ژنوتیپهای مختلف یک ژن مطلوب و همچینین مطالعات جمعیتی و آزمون انساب استفاده می شود. مزیت انکارناپذیر این تکنیکها، تجریه و تحلیل سریع اطلاعات ژنوم در یک جمعیت با استفاده از مقادیر بسیار ناچیزی از DNA می باشد. بنابراین در قدم اول نیاز به استفاده از یک روش استخراج DNA که سریع و بی خطر و مقرون به صرفه باشد، همواره احساس می شود. چندین روش مختلف به منظور حداقل کردن مراحل استخراج DNA ، توسط محققان مختلف گزارش شده است. در این تحقیق اقدام به مقایسه روشهای مختلف استخراج DNA از خون، شیر، ریشه مو، اسپرم گردید. کیفیت و کمیت استخراج با دو روش اسپکتوفتومتری و ژل مونتیورینگ مشخص شد. و در نهایت برای ارزیابی کیفیت DNA استخراج شده ، انجام تکنیکهای (RAPD) با استفاده از آغازگر تصادفیOPU13 و RFLP با استفاده از آغازگرهای اختصاصی 24 جفت بازی طراحی شده برای تکثیر 422 جفت باز از اینترون دو ژن لپتین و با استفاده ازآنزیم برشی Sau3AI، صورت پذیرفت. در نهایت روش سیلیکا ژل روشی منلسب، مقرون صرفه برای استخراجDNA برای سلولهای مختلف پیشنهاد می گردد.
کلمات کلیدی: استخراج DNA، روش جوشاندن، روش فنل کلروفورم، مارکرهای مولکولی
مقدمه:
نقطهِ شروع بسیاری از روشهای بیولوژی مولکولی، ضرورت جداسازیDNAبا کیفیت عالی است. معمولا کیفیتDNA با عواملی از قبیل عدم آلودگی ناشی ازRNA، پروتئین، لیپید و سایرساختارهائی که برای آنزیمهای برشی و پلی مرازها مزاحمت ایجاد می‌کنند سنجیده میشود.(1و4) به‌علت بزرگ بودن اندازهِ DNA ژنومی در پستانداران، روشهای استخراج DNA باید حداقل استرس‌مکانیکی را در طی استخراج ایجاد نمایند. معمولإ روشهائی که در آنها چندین شوینده همچونSDS وTritonX100 استفاده میشود،که نقش آنها لیز نمودن سلول و کمک به از بین بردن پروتئین متصل بهDNA می‌باشد. پروتئین‌زدائی بیشتر از طریق پروتیئنازK صورت می‌گیرد که این ماده در بافر لیز کننده مورد استفاده قرار می‌گیرد(4). این آنزیم در حضورSDS در دمایc56-65فعالیت دارد تحت این شرایط پروتئین بهتر واسرشت میشود برعکس در همین شرایط آنزیمهای دیگر مثلDNAase دناتوره میشود.متعاقب استفاده از پروتیئنازK از ایزوپروپانول برای از بین بردن موِثر پروتئین‌ها استفاده میشود و باقیمانده پروتئین و لیپید نیز بطور موِثر از طریق کا ربرد فنل و کلروفورم از بین می‌رودآلودگیRNA از طریق تیمار کردن نمونه با RNAase از بین می‌رود. در روشهای دیگر بعد از پروتئینازK از نمک اشباع برای رفع آلودگی پروتئین استفاده میشود در استخراجDNA از هپارین برایPCR بهتر است استفاده نشود چون هپارین از فعالیتTaq پلیمراز جلوگیری می‌کند .وجودEDTA حداقلmM 2در بافر استخراج باعث میشود که کوانزیمهای آنزیمAaseDNبا EDTA شلات شود و از تجزیه تصادفیDNA جلوگیری نماید(1و4و5)
. دستورالعمل استخراجDNA با پشتوانه‌ای از دانش بیوشیمی همراه است و نباید صرفا استفاده از چند ماده انگاشته شود، درک عملکرد هر ماده این امکان را فراهم خواهد نمود که درصورت نبود یک ماده از ماده دیگری با کار مشابه استفاده کرد. در این تحقیق از روشهای استخراجDNA استفاده گردید که در زیر به جزئیات آنها اشاره میشود.
مواد و روشها
نمونه های خون اسپرم ، شیر ، ریشه مو از گاوهای بومی وگاومیش جمع آوری گردید. خونگیری در گاوهای بزرگ از ورید دمی ودر گوساله ها از وریدوداج صورت گرفت. سپس نمونه ها از مزرعه داخل لوله های حاوی خلا و EDTA همراه با یخ به آزمایشگاه اصلاح نباتات مولکولی دانشگاه تبریز گردید و تا زمان استخراج در 20 درجه سانتیگراد نگهداری گردید.
تخلیص DNA
در این تحقیق، تخلیصDNA برروی اسپرم ، گلبولهای سفید خون ، شیر و ریشه مو انجام پذیرفت .
روش جوشاندن
ابتدا 5/0 سی سی خون در تیوبهای 5/1 میلی لیتر که فاقد هرگونه آلودگی می باشد ریخته و به میزان یک میلی لیتر بافر R(mM10 تریس 5/7 =pH ،mM 33/0 ساکاروز ،mM 10 کلرید منیزیم و1% تریتون 100X ) اضافه و خوب آن را مخلوط و به مدت دو دقیقه با سرعت g1000 سانتریفوژ می کنیم سپس محلول روئی دور ریخته و مراحل را آنقدر ادامه می دهیم تا رسوب سفید رنگ شود. سپس 100 میکرولیتر محلول (mM 50 هیدروکسید سدیم ) اضافه و به مدت 20 دقیقه در آب حوش قرار داده می شود ، تا گلبولهای سفید لیز شوند بعد از آن 20 میکرولیتر محلول (mM 1بازتریس 5/7 = pH ) اضافه و بعد از سانتریفوژ کردن به مدت 30 ثانیه در g1000 محلول روئی را در تیوب جدید منتقل وتا زمان انجام آزمایشها در 20 – درجه سانتیگراد نگهداری می شود(3).
تخلیص DNA به روش Salting out
ابتدا گلبولهای قرمز توسط بافر R لیز شده و گلبولهای سفید رسوب داده می شود. سپس 300 میکرو لیتر بافر هضم کننده(mM 10بازتریس، EDAT، mM20، M44/0 کلرید سدیم) اضافه و سپس 20 میکرولیترٍSDS (10%) به تیوب اضافه می کنیم و بعد 5 میکرولیتر پروتئینازK (20 میلیگرم در میلی لیتر) به تیوب مربوطه اضافه می کنیم . تیوپ مربوط را در دمای 55 درجه به مدت 2 ساعت یا در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت یک شب قرار داده تا عمل هضم سلولی بخوبی صورت گیرد.100 میکرولیتر محلولNaCl اضافه می کنیم و10 الی30 دقیقه در یخ یا فریزر20 – قرار می دهیم. سپس سانتریفوژ با سرعت g13000 صورت می گیرد. جهت شستشوی رسوب مقدار اتانول 70% به میزان 5/0 میلی لیتر اضافه گردیده و با دور g13000 در دمای 4 درجه به مدت 5 دقیقه سانتریفوژ صورت گرفت. بعد از خشک شدن رسوب DNA مقدار 100 میکرولیتر TE (mM1EDTA، 8 pH ، mM10 بازتریس 6/7 pH ) جهت حل شدن آن اضافه گردیده و سپس نمونه ها در20 – درجه سانتیگراد به منظور بررسی مولکولی نگهداری می شود(4) .
تخلیص DNA به روش تیوسولفات گوانیدین – سیلیکاژل
شیرحاوی انواع مختلفی از سلولها می باشد که در مجموع سلولهای سوماتیک(Somatic Cell) نامیده می شود . در شیر به طور معمول سلولهای نوتروفیل، ماکروفاژ، لنفوسیت و ائوزینوفیل وسلولهای اپتلیال وجود دارد. به لحاظ وجود حساسیت شدید گاوهای بومی کشور و خوی نا آرام آنها که همواره عملیات خونگیری را دچار مشکل کرده است ، دستیابی به DNA ژنومی از نمونه های شیر راه کم خطر و مناسبی به نظر می رسد.10 میلی لیتر نمونه شیر در داخل لوله های آزمایش درب دار حاوی فرمالدئید جمع آوری گردید و برای استخراج سانتریفوژ g10000 به مدت 10 دقیقه صورت پذیرفت و محلول روئی دور ریخته شد. سپس رسوب باقی مانده با محلول سالین شستشو داده شد . بقیه مراحل طبق روش تیوسولفات گوانیدین- سیلیکاژل انجام پذیرفت. 500 میکرولیتر بافر هضم کننده (M5 تیوسیونالات گوانیدن،mM 20EDTA،mM40 Tris،40 گرم ,TritonX10010 گرم DTT ) به نمونه شیر اضافه شده، نمونه ها به مدت 5 دقیقه در بن ما ری حاوی 65 درجه سانتیگرا د قرار گرفت. سپس 20 میکرولیتر محلول نوکلئاز(4 گرم ذرات سیلیکا،100 میکرولیترگوانیدین) اضافه شد و به مدت 10 دقیقه به آرامی ورتکس گردید. سپس به محیط همگن شده، 400 میکرو لیتر بافرسالین EDTA 20mM , Tris-HCl 10mM , KCl 1M , NaCl 1M ) ) اضافه و در نهایت از طریق ماده Extra Gene (10% رزین 02/0 % ماده رنگی OrangG،01/0 درصدTriton X 100 ) ، DNA زرد رنگ از سایر ناخالصیها جدا گردید(2) .
استخراج DNA از اسپرم و ریشه مو
استخراج DNA از پایتهای اسپرم با روشهای متداول ذکر شده امکان پذیر است، اما به جهت اینکه اسپرم مقدار زیادی کلسترول و نمک دارد، با استفاده از بافر ٍٍPBS، مقادیر کلسترول و نمک از رسوب شستشو می شود و سپس از روشهای ذکر شده می توان در ادامه استخراج استفاده نمود. در مورد ریشه مو قبل از استفاده از روشهای ذکر شده باید ریشه های مو با اتانل 70 % چربی زدائی شوند. سپس در روی یک کاغذ صافی در 65 درجه خشک شود. سپس 5/0 سانتیمتر از قسمتی که حاوی ریشه های موی است با قیچی جدا می کنیم و در داخل تیوپ حاوی 100 میکرولیتر بافرA (200mM ، NaoH و DTT 50 mM ) قرار می دهیم و 15 دقیقه در دمای 97 درجه سانتیگراد حرارت می دهیم و سپس سایر مراحل را طبق روشهای ذکر شده انجام می دهیم .
آغازگرها
برای موفقیت و دقیق بودن واکنش زنجیره پلی مراز ، آغاز گرها از ویژگی خاصی باید برخوردار باشند. آغازگرتصادفی مورد استفاده برای واکنش RAPD، OPU13 خریراری شده از شرکت Operon بود .و برای انجام تکنیک PCR-RFLP از پرایمرهای اختصاصی برای تکثیر بخشی از اینترون ژن لپتین استفاده شد. این دوجفت24 mer بودند که ناحیه ای از اینترون دو ژن لپتین گاوی را تکثیر می سازد ساخت پرایمرها دوم توسط شرکت روسی SYNTOL صورت پذیرفت. توالی مورد تکثیردر ژن بانک(EMBL) با شماره Y11369.1 موجود است.
واکنش زنجیره‌ای پلیمراز
مواد وغلظت مناسب برای 25 میکرولیتر واکنش تهیه گردید. انجامPCR با استفاده از کیتGenepak PCR Universal صورت گرفت. از مزایای این کیت اینست که آنزیم Taq DNA پلی مراز به کمک آنتی بادی مهار شده است وتنها در درجه حرارت بالا ( بالای 90 درجه ) این آنتی بادی تخریب شده و آنزیم را رها می نماید لذا PCR به صورت Hot-Star انجام می گیرد. به تمام میکروتیوپها 10 میکرولیترPCR Diluent اضافه می کنیم و میزان غلظت آغاز گرهای مورد استفاده 20-10 پیکومول می باشد واکنش زنجیره پلی مراز برای تکثیر ژن لپتین در ترموسایکر با برنامه (دناتوره شدن اولیه 93 درجه سانتیگراد، به مدت 2 دقیقه، دمای اتصال 55 درجه به مدت یک دقیقه، دمای تکثیر 72 درجه به مدت1 دقیقه ، دمای دناتوره شدن 93 درجه سانتیگراد، به مدت 1 دقیقه، دمای تکثیر نهائی 72 درجه سانتیگراد به مدت 3 دقیقه ) با 33 سیکل انجام پذیرفت .برای واکنش PCR-RAPD ازبرنامه حرارتی، 94 درجه به مدت 2 دقیقه،94 درجه به مدت 30 ثانیه، 45 درجه به مدت 30 ثانیه، 72 درجه به مدرت 30 ثانیه و بسط نهایی 72 درجه به مدت 10 دقیقه در 45 سیکل استفاده گردید.
هضم آنزیمی
عمل هضم آنزیمی در حجم 30 میکرولیتر با مصرف 15 واحد آنزیمی تحت شرایط بافری و دمای مناسب با استفاده از آنزیم برشی Sau3AI که سایت برشی GATC را شناسایی می کند صورت پذیرفت
الکتروفوز محصولات PCR و هضم
ابتدا آگارز 8/1 % با بکار گیری بافرTBE 1 ، ./09mM تریس ، ./09mM اسید بوریک و EDTA./02mM ) تهیه و به ازای هر10 میلی لیتر ژل 2/0 میکرو لیتر اتیدیوم بروماید (10mg/ml) به آن اضافه کرده و در ظرف مخصوص حاوی شانه ریخته می شود.بعد از بسته شدن ژل، به ازای 7 میکرولیتر محصول PCR با دومیکرولیتر لودینگ بافر( بروموفنل بلو 25/0 درصد، ساکارز40 % ) مخلوط نموده سپس در چاهکهای ژل قرار داده می شوند . با ولتاژ بالا حدود 100 ولت شروع تا اینکه نمونه ها از چاهک خارج شود سپس ولتاژ را به حدود 70 ولت رسانیده و سپس از یکساعت الکتروفورز نمونه ها با استفاده از دستگاه نور ماورا بنفش مورد بررسی قرار می گیرند
بحث:
نتایج نشان داد که کیفیت و کمیت DNA حاصله و روش سیلیکا ژل و Salting out بهتر ومطلوبتر از روش جوشاندن است و از نظرفیزیکی نیزکمتر باعث فرسودگی DNA میشود. روش جوشاندن باعث ایجاد DNA بصورت اسمیر و حاوی پروتئین زیاد می شود غلظت DNA حاصله در روش جوشاندن 140-190mg/ml و در روش Salting out و سیلکاژل 400μg/ml محاسبه شد.
یک قطعه bp 422 از ژن لپتین که شامل اینترون می شد توسط PCR تکثیرگردید و برای هضم آنزیمی از sau3AI استفاده شد.روش گوانیدین –تیوسولفات روش مناسبی است که در آن ذارت سیلیکون به جای فنل و پرو پانل در رسوب دادنDNA از مخلوط لیز سلولها می باشد. در این روش در حضورغلظت بالای نمک سیلیکا به رشته های DNA چسبیده و آنها را رسوب می دهند و در حضور غلظتهای پایین نمک آن را رها می کنند و بنابراین از این خاصیت می توان به جای رسوب دادن اتانل یا ایزوپروپانل از این ذرات استفاده کرد. از مزایای دیگر این کیت اینست که در مرحله نهایی DNA در فاز زرد رنگ قرار می گیرد و در نتیجه به آسانی قابل جا شدن از سایر ناخالصیهای نامطلوب می باشد. از این روش می توان از خون کهنه و یا حتی لخته شده نیز برای استخراج استفاده کرد.
مطالب مرتبط